妇科复杂疾病遗传易感基因的全基因组筛选及功能分析

来源 :华中科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lenchoguo
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研究背景及目的:子宫内膜异位症(简称内异症,endometriosis, EM)是育龄妇女的多发病、常见病,近年来发病率呈明显上升趋势,高达10%-15%,占妇科手术的30%以上严重威胁妇女的身心健康及生活质量,给患者家庭乃至整个社会带来诸多不稳定因素。内异症虽为良性病变,但异位内膜慢性侵袭性生长、扩散和复发呈现类似于恶性肿瘤的生物学特征。内异症的发生机制尚不明了,临床诊治效果亦不理想,深入探讨内异症发病的分子机理进而建立有效的诊断和防治新方法,是目前国内外妇科学家们关注的重点课题。越来越多的证据表明,内异症与心血管疾病、癌症、哮喘、糖尿病、精神病等疾病一样,是以多基因遗传为基础,多因素共同激发的遗传易感性疾病。然而在过去的研究中,学者们多依据内异症患者子宫内膜的特点,如侵袭性强,凋亡下降等对致病基因进行猜测性探索,结果只得到一些内异症相关基因的松散证据。本研究选择从全基因组范围筛选子宫内膜异位症遗传易感基因,并对易感基因致病相关功能进行分析。材料方法:收集经手术证实子宫内膜异位症患者作为内病例组,组或非内异症良性病变患者作为对照组,采集病例组及对照组全血。提取全基因组DNA进行AffymetrixSNP 6.0芯片分析,采用silhouette和adjusted t-test比较病例对照组筛选出差异SNP位点,并找出连锁的相关致病基因—-MEIS1.免疫组化及western blot探讨MEIS1在内异症及非内异症患者间表达差异。构建MEIS1反义慢病毒载体,转染原代培养内膜细胞,MTT检测其对增殖功能影响,流式检测其对内膜细胞凋亡能力的影响结果:病例及对照组DNA采用Affymetrix SNP 6.0 array分析后,cel文件silhouette法筛选出185个SNP位点,adjusted t-test筛选出最显著的100个SNP位点。有16个SNPs在两种方法中均检测到。该16个SNPs作为进一步研究的候选位点,依次检索其连锁基因从中筛选出MEIS1.免疫组化及western blot证实在P2,P3,S1,S2期内异症患者的子宫内膜细胞中MEIS1表达均低于对照组。构建MEIS1反义慢病毒载体,转染原代培养内膜细胞,MTT检测显示沉默MEIS1可增强内膜细胞增殖能力,流式结果显示沉默MEIS1可降低内膜细胞的凋亡。结论:全基因组关联法筛选出的MEIS1是内异症发病的相关基因,其在内异症患者子宫内膜中表达降低并影响其凋亡能力,从而促进内异症的发生。研究背景与目的:宫颈癌是严重威胁妇女生命健康最常见的恶性肿瘤之一,在全球女性恶性肿瘤中其发病率仅次于乳腺癌,在发展中国家则居于首位。近年来,早期宫颈癌的发生,特别是年轻化趋势十分明显。HPV无疑是宫颈癌的首要病因,但临床上90%有HPV感染的女性会在4-6个月自动转阴,只有部分高危HPV持续感染者进展为宫颈癌.这说明在宫颈癌的发生过程中,还有其他一些危险因素发挥作用。近年来研究表明,除环境与生活方式等外界因素外,宿主遗传背景差异与疾病的发生发展密切相关。一直以来,对于宫颈癌宿主遗传背景的研究多采用候选基因法。而对变异基因的研究也多围绕HPV致癌蛋白E6 E7作用的P53等分子及其参与的凋亡、增殖等通路展开,而对于细胞癌变的重要屏障细胞衰老及侵袭转移乃至癌症发生的重要生物学行为上皮间质化(epithelial mensenchymal transition,EMT)研究甚少。HGP完成和高通量筛选技术的创立为在全基因组范围内筛选宫颈癌发生发展相关基因,并进行更深入的癌变机制探讨奠定了基础。材料方法前期本实验组采用CGH芯片对宫颈癌组织进行CNV筛选,得到癌组织基因组扩增及缺失片段,本课题选择其中的TWIST基因进行进一步的功能分析。1选取宫颈上皮内瘤变以及早期、晚期宫颈癌组织,制成石蜡切片,免疫组化研究TWIST1/2、CBX3、E-cadherin表达,从组织水平分析宫颈上皮内瘤变至癌变过程中TWIST的表达与细胞衰老、EMT表型的相互关系及临床意义。2构建TWIST真核表达载体及小干扰RNA转染宫颈癌细胞。光镜观察转染前后细胞形态变化,对细胞EMT、衰老状况进行评估。半乳糖苷酶衡量细胞衰老进展、E-cadherin免疫荧光染色观察细胞EMT改变。3在细胞发生衰老和EMT变化后,利用流式细胞学、半乳糖苷酶染色、MTT、划痕实验、transwell等系观察转染前后细胞凋亡、衰老、增殖、运动、侵袭转移等生物学行为的改变。结果1免疫组化结果显示:TWIST1/2在从宫颈上皮内瘤变到宫颈癌的过程中表达逐渐升高,差异有统计学意义。在宫颈癌病例中,有淋巴结转移的病例中癌组织TWIST表达升高,回归分析结果证实TWIST是宫颈癌转移的危险因素。此外在宫颈癌变过程里,以CIN早期衰老状态明显,当病变发展至CIN3及宫颈癌时衰老屏障被越过。同时,E-cadherin在从癌前到侵袭性癌的过程中表达逐渐降低,并从细胞膜转移至胞浆。在TWIST表达升高的病例中可见明显的E-cadherin异常表达。2转染了siTWIST的宫颈癌细胞可见明显的衰老状态,半乳糖苷酶染色加深,细胞排列更紧密。转染正义TWIST表达载体的宫颈癌前病变及宫颈癌细胞细胞排列松散,极性减退,间质化表现明显。免疫荧光结果显示:上调TWIST的表达可使细胞骨架染色增强,E-cadherin表达降低并由薄膜转移至胞浆。3转染了siTWIST的宫颈癌细胞较之对照组可见凋亡上调,增殖能力减弱。细胞运动减慢,侵袭能力降低。结论TWIST是宫颈癌发生发展过正中重要的转录因子,其在宫颈癌变过程中表达逐渐上调,使细胞越过衰老屏障,进入EMT状态,引起细胞凋亡降低,增殖增强,侵袭转移上调,从而参与了宫颈癌的发生发展。目的研究蛋白酶体抑制剂——硼替佐米联合顺铂作用于卵巢上皮性癌(卵巢癌)顺铂耐药细胞的效果,并探讨其诱导细胞凋亡的分子学机制。方法实验分为4组,硼替佐米(50 nmol/L)+顺铂(40μmol/L)、硼替佐米(50 nmol/L)、顺铂(40μmol/L)、空白对照组(未加药物)。采用四甲基偶氮唑蓝比色法测定各组卵巢癌顺铂耐药细胞株C13细胞培养不同时间(12、24、36、48、60及72 h)后的增殖活性(以细胞存活率表示),膜联蛋白-碘化丙啶双染色法流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率;并采用蛋白印迹法检测各组细胞内凋亡抑制蛋白短亚型(cFLIPs)蛋白的表达水平,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8(caspase-8)活性检测试剂盒检测各组细胞内caspase-8的活性。结果硼替佐米+顺铂组显示较好的抑制效果,作用12、24、36、48、60及72 h时其细胞存活率分别为(56.0±8.4)%、(44.7±7.3)%、(33.7±11.2)%、(27.6±8.0)%(27.6±7.6)%和(28.1±2.4)%,均明显低于顺铂组各时间点(P<0.05)。作用24 h时,顺铂、硼替佐米、硼替佐米+顺铂组细胞凋亡率分别为(16.7±1.7)%、(23.4±2.1)%和(26.9±1.6)%,硼替佐米+顺铂组明显高于顺铂或硼替佐米组(P<0.05)。各药物处理组细胞内cFLIPs蛋白表达水平均不同程度下降,以硼替佐米+顺铂组[(43.2±2.3)%]降低最为明显,分别与顺铂、硼替佐米组[分别为(75.7±3.0)%、(67.9±2.1)%]比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。顺铂、硼替佐米和硼替佐米+顺铂组细胞内caspase-8活性分别为空白组的(2.3±1.0)、(4.2±0.9)和(5.6±1.6)倍。结论蛋白酶体抑制剂——硼替佐米联合顺铂能增强卵巢癌顺铂耐药细胞的化疗敏感性;由药物作用后cFLIPs表达的降低和caspase-8活性的增强推测,cFLIPs/capsape-8信号传导通路在硼替佐米联合顺铂诱导细胞凋亡中发挥了重要作用。
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