非洲猪瘟病毒P30蛋白的表面展示与抗原性分析

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非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的全球流行猪科动物传染病。被ASFV感染的猪会表现出从急性到慢性的各种临床症状,在数天内便可能死亡。由于目前没有针对治疗ASF的疫苗或治疗方法,该疾病不受控制蔓延至欧洲、南美洲、北美洲、亚洲等诸多国家。2018年8月我国报道第一例ASF,随后一直流行在我国,截至2021年7月16日全国范围内暴发疫情192起,扑杀生猪100万头以上,给我国乃至全球养猪业造成巨大的损失和严重威胁。目前迫切需要开发出快速、高效的ASF诊断试剂来控制ASF疫情,研制安全有效的疫苗来预防ASFV入侵,为国内生猪养殖提供保障。本研究将ASFV P30蛋白展示在杆状病毒的病毒粒子包膜表面或病毒感染的细胞表面以研究其免疫原性。以Bac-to-Bac转移载体质粒pFPG为骨架,在杆状病毒膜融合蛋白基因gp64启动子下游插入融合表达框gp64SP-Fp30-gp64TMD,该表达框中含有gp64基因的信号肽序列,并融合含有FLAG标签的p30基因,同时下游融合了gp64基因的跨膜区和胞内区。我们期望该表达框通过表达GP64信号肽将P30蛋白转移到膜表面,并通过跨膜区和胞内区锚定在细胞膜或病毒包膜上。重组质粒命名为pFPG-gp64-Fp30,经PCR、双酶切及测序验证后,将构建好的重组质粒转化DH10Bac进行转座,再经抗性与蓝白斑筛选获得含有p30基因的真核表达载体。继而转染Sf9细胞,获取重组杆状病毒Bacmid-gp64-Fp30。重组杆状病毒的表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析,表达产物23.6kDa,与预期大小一致。此外,免疫荧光结果显示P30能锚定在Sf9细胞表面。在重组病毒感染Sf9细胞96 h时,收集裂解细胞作为免疫原进行动物免疫试验,采集免疫鼠血清进行间接ELISA、蛋白免疫印迹(Western-blot)实验,测得免疫鼠阳性血清效价为1:12800,结果表明表面展示的目的蛋白P30抗原免疫原性较强,同时Western-blot和间接ELISA实验证明其能诱导产生较强特异性抗体。P30蛋白表面展示的优良免疫原性为开发出较高灵敏度的ASFV诊断试剂盒以及ASF疫苗的研究奠定了良好的基础。
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